三维细胞培养通过模拟体内微环境，更真实反映细胞形态、功能及相互作用，广泛用于肿瘤研究、药物筛选、再生医学等领域。掌握从样品制备到结果分析的规范流程，是保障实验重复性与数据可靠性的核心。
一、样品制备：奠定培养基础
细胞准备：选择对数生长期细胞(活性≥90%)，用胰酶消化(如0.25%胰酶，37℃孵育2-5分钟)后，以含10%胎牛血清的培养基终止消化，1000rpm离心5分钟收集细胞；用PBS洗涤2次，调整细胞浓度至1×10⁵-1×10⁶cells/mL，避免浓度过高导致细胞聚集或过低影响三维结构形成。
支架/基质选择与处理：根据细胞类型选适配载体——肿瘤细胞常用Matrigel基质胶(4℃解冻，避免反复冻融)，按1:1比例与细胞悬液混合；干细胞可选用明胶海绵或聚乳酸(PLA)支架，使用前用培养基浸泡2小时，去除残留杂质并预湿，确保细胞均匀附着。
接种操作：将细胞-基质混合物加入培养容器(如超低吸附培养板、Transwell小室)，Matrigel体系需先37℃孵育30分钟使基质胶凝固，再加入培养基；支架体系直接滴加细胞悬液(每cm²支架滴加0.2mL悬液)，静置1小时让细胞充分吸附，再补加培养基至覆盖支架2mm。
二、培养操作：维持微环境稳定
环境控制：置于37℃、5%CO₂培养箱，每日观察培养基颜色(pH值变化)，2-3天更换一次培养基(肿瘤细胞三维培养换液量为总容积的1/2，避免扰动球体结构)；若使用微流控芯片培养，需通过泵体控制培养基流速(0.1-0.5mL/h)，维持营养持续供给。
形态监测：每日用倒置显微镜观察细胞聚集情况——肿瘤细胞通常3-5天形成直径100-300μm的类器官，干细胞可形成spheroid结构；若出现细胞分散(可能是基质胶浓度不足)或过度聚集(需降低接种密度)，及时调整培养条件。
污染防控：操作全程在超净台进行，培养基添加双抗(青霉素-链霉素，终浓度100U/mL)；若发现真菌或细菌污染(如培养基浑浊、出现菌落)，立即终止培养，避免交叉污染其他样品。
三、结果分析：多维度评估培养效果
形态与活性分析：通过倒置显微镜或激光共聚焦显微镜观察类器官形态(如完整性、大小均一性)，用ImageJ软件测量直径(每组至少统计30个类器官，误差≤±10%)；采用CCK-8法检测细胞活性，避光孵育2小时后测450nm吸光度，活性≥80%为合格。
功能与分子检测：提取细胞总RNA或蛋白，通过qPCR检测特异性基因(如肿瘤细胞的Ki-67增殖基因、干细胞的Oct4干性基因)表达水平，验证细胞功能；免疫荧光染色(如用CD44抗体标记肿瘤干细胞)观察蛋白定位，共聚焦成像分析细胞表型。
数据记录与分析：记录培养天数、细胞形态变化、活性数据，建立“培养条件-结果”关联表；采用统计学软件(如SPSS)进行组间差异分析(P<0.05为显著差异)，生成实验报告，标注异常数据(如类器官破裂、活性骤降)及可能原因(如培养基配方不当、培养箱CO₂浓度波动)。
综上，三维细胞培养需“精准制备、稳定培养、科学分析”，严格遵循各环节操作规范，可有效提升类器官形成率与实验重复性，为后续研究(如药物敏感性测试、机制探索)提供可靠的细胞模型。
更新时间：2025-08-25
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